禽流感檢測方法研究進展
1 病毒的分離鑒定
無菌采集病料經處理后接種9～11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性，若為陰性則應繼續(xù)盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HI）試驗，以排除ND感染。然后用免疫擴散等方法來檢測特異性核心抗原——核糖蛋白（NP）或基質蛋白（MP），再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時，進行致病力試驗，確定毒力強弱。
病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實，但操作程序繁瑣，費用多，耗時費力。
2 血清學診斷技術
2．1 瓊脂擴散（AGP）試驗進行病毒抗原型特異性鑒定
即用已知陽性血清和未知抗原進行AGP試驗。受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白（KNP）基質蛋白（MP）抗體，因而適用于鑒定流感病毒。1979年Beard首次將AGP用于食流感抗體的檢測。
此法雖然簡單易行，但是敏感性較差，易出現假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散，陳海燕分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎上建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內得到推廣應用，并取得良好的效果。
2.2 血凝(HA)血凝抑制試驗（HI）
一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或MP抗原型（用AGP）確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定。
現已有人采用改進HA試驗方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價比常規(guī)法高2－4倍，若抗原用乙醚裂解，其敏感性比常規(guī)法高4～6倍，但觀察時以30分鐘內為好，否則易出現假陽性。另外，還應注意在HI試驗時，應先除去非特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細胞表面受體競爭性地作用于病毒表面的血凝素而發(fā)生非特異性凝集反應。通常用廣州健侖生物科技有限公司供應的受體破壞酶（RDE）即霍亂菌培養(yǎng)液處理法或高碘酸鈉法制備血清。
HA、HI特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，并且由于用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴散實驗簡便和快捷。
2．3 神經氨酸酶抑制試驗（NIT）
根據A型流感病毒的表面抗原特性，特別是血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）特性，不僅可通過HI試驗對病毒進行鑒定，而且可通過NI試驗進行鑒定。1983年R.A.Van．Deusen介紹了NI試驗的一種改進法——平板微量NI試驗，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法。試驗證明，微量NI試驗能對分離物做出準確鑒定，而常量NI試驗檢測亞型混合物更敏感。
目前國立獸醫(yī)實驗所已將微量NI試驗列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規(guī)方法。診斷中也已廣泛采用此法，特別是美國在80年代火雞發(fā)生流感病毒期間，各次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已被病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。這種方法已被證明是快速的，且成本較低和有可重復性。這種技術的可靠性將導致NI試驗的廣泛應用。
2．4 中和試驗（NT）
以中和試驗（NT）來鑒定或滿定流感病毒時，常用雞胚或組織培養(yǎng)細胞，操作方法與其他病毒（如NDV）的中和試驗相同。
NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸附到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。因此，某一個血清型的中和實驗機體只與同組內的其他病原表現出有限的交叉反應。
病毒中和實驗操作繁瑣耗時費料，臨床上幾乎不用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方法都要以此作為標準進行比較。
2.5 免疫熒光技術（IFT）
免疫熒光技術就是熒光抗體技術（FAT）。IFT早在1961年就開始用于人類流感的快速診斷。1984年美國賓西法尼亞州爆發(fā)禽流感時Skeeles將IFT首次用于AIV的檢測。IFT最早用于病毒的鑒定和定位病毒感染細胞中特異性抗原，主要是核內熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也有部分熒光。
用于禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法，即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光，一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。
IFT用于診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點，而且費用較低。其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高于用雞胚進行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標本中出現的假陽性問特異性熒光）問題。
對一株雜交瘤細胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進行檢測時，發(fā)現間接固相免疫熒光技術的敏感性比HI高 40－150倍。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白（NP）基質蛋白（MP）抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解。
2．6 酶聯免疫吸附法（ELISA）
1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產生的抗體消長規(guī)律進行了檢測，Lanbre認為ELISA的敏感性遠高于HI補體結合反應。Meulemans（1987）對ELISA．AGP，HI檢測AIV抗體 進行了比較研究，發(fā)現 AGP和 ELISA一樣均能檢測型特異性抗原（抗體），但敏感性遠低于ELISA，HI適用于亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993年，Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應板，建立了快速診斷的DAS～ELISA，大大縮短了診斷時間，并可保留ELISA的特異性、敏感性，其結果又不需要特殊儀器分析，可用肉眼判定。
隨著分子生物學技術的發(fā)展，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所的李海燕等用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S。昆蟲細胞，以其表達產物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接（重組核蛋白）ELISA診斷技術（rNP－ELISA，確定了其最適工作條件，并對3 138份雞血清進行了檢測，實驗證明，rNP－ELISA與全病毒間接ELISA（AIV－ELISA），AGP及HI的符合率分別為99.9％，97.1％，98.8％;并能100％檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品，這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量?？旖?、經濟的血清學診斷技術。
ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關。1984年Abraham等報道了抗原快速提純法，所需時間比常規(guī)法縮短10倍，并且研究結果表明應用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應。
目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學普查及早期快速診斷的最有效和最實用的方法。
3 分子生物學技術
3.1 聚合酶鏈反應（PCR）及反轉錄一聚合酶鏈反應（RT——PCR）
PCR是近來發(fā)展成熟起來的一種體外基因擴增技術，能在數小時內使DNA呈指數增加，已成功地用于多種病毒的基因檢測和分子流行病學調查等。其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列，對待測樣品進行PCK擴增。如果檢測出了相應的擴增帶，則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。
鑒于引起致病的禽流感病毒多是H5和H7血清亞型，在PCR技術的基礎上，崔尚金等（1998）建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV已亞型RNA的RT－PCR反應，并將此法與AGP和電鏡技術作了比較，結果表明引物的特異性決定了產物的特異性，并且該方法靈敏度高，檢測過程僅需到。時左右，并且大大縮短了感染后的檢出時間。
應用毛細管PCR（15分鐘30個循環(huán)）代替常規(guī)PCR（2．5個小時30個循環(huán)）以進一步縮短檢測時間的研究也已展開并進入更深入的領域，以期用于不同樣品（組織、組織液、分泌液、糞便等）的檢測，區(qū)分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學調查及發(fā)病機制中的應用價值，為我國AIV的綜合防治措施做出貢獻。
3．2 核酸探針技術
核酸分子雜交技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異性DNA或RNA的有力工具。
核酸探針技術的原理：在進行雜交時，用一種預先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測未知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補區(qū)段形成氫鍵，從而結合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去末雜交上的標記物，然后進行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補的DNA或ILNA序列。
Bashiruddin等（1991）報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應用前景。
3．3 熒光PCR法
利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內屬于首次，而且在國際上也屬于先進水平。它與國際標準方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養(yǎng)，而且時間也由原來最短的21天縮短為4小時。
4 電鏡技術
由于流感病毒為正粘病毒，屬于形態(tài)特征性強的病毒，因而可用電鏡技術來診斷，為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術外，取病料的部位和時間也是獲得準確檢驗結果的關鍵。病料的采集部位及取材時間應根據禽流感病毒在動物體內的分布特征及其感染特性而定。
5 展 望
在以上各種檢測方法及科學技術發(fā)展的基礎上，將PCR技術與ELISA技術結合起來，建立一種新的實驗室檢測AIV的方法，將有較大的研究價值。其實驗原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標記法為例）如下：
PCR的一對引物中，其中一種引物用生物素標記，另一種引物用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素包被（生物素的親和素與生物素特異的結合）。PCR擴增后經純化去除引物、dNTP、引物二聚體等小分子后，將PCR擴增后純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物素親和素一生物素一PCR片段一地高辛一抗地高辛一酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由于該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統，即PCR放大和ELISA放大，故而它的靈敏度更高。同時這種方法避免了PCR產物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。
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